L'analyse du microbiome du soja fermenté traditionnel thaïlandais révèle une courte

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 7573 (2023) Citer cet article

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Thua Nao est un aliment de soja fermenté traditionnel thaïlandais et un supplément de protéines à faible coût. Cette étude visait à évaluer la communauté bactérienne de Thua Nao dans le nord de la Thaïlande et à évaluer les bactéries potentiellement actives liées aux acides gras à chaîne courte (AGCC). Soixante-cinq Thua Nao comprenant 30 échantillons humides et 35 échantillons séchés ont été collectés dans six provinces : Chiang Rai, Chiang Mai, Mae Hong Son, Lampang, Lamphun et Phayao. La diversité bactérienne était significativement plus élevée dans les échantillons humides que dans les échantillons secs. Les phylums dominants étaient Firmicutes (92,7 %), Proteobacteria (6,7 %), Actinobacteriota (0,42 %) et Bacteroidota (0,26 %). Le genre Bacillus (67%) était le plus représenté dans tous les échantillons. Lactobacillus, Enterococcus et Globicatella ont été enrichis dans les échantillons humides. L'évaluation des relations SCFA-microbiote a révélé que des concentrations élevées de butyrate et de propionate étaient associées à une abondance accrue de Clostridiales, et que des concentrations élevées d'acétate étaient associées à une abondance accrue de Weissella. Les produits humides contenaient plus d'AGCC, notamment l'acétate (P = 2,8e−08), le propionate (P = 0,0044), le butyrate (P = 0,0021) et l'isovalérate (P = 0,017), que les produits séchés. Ces résultats donnent un aperçu des associations SCFA-microbiote à Thua Nao, ce qui pourrait permettre le développement de cultures starter pour la production de Thua Nao enrichie en SCFA.

Thua Nao (soja fermenté) est un aliment du nord de la Thaïlande à haute valeur nutritionnelle et est similaire à des produits tels que le natto au Japon, le chongkukjang en Corée et le kinema en Inde1. Trois ingrédients principaux (c'est-à-dire le soja, l'eau et les microbes naturels) sont nécessaires pour produire le Thua Nao, qui se déroule en quatre étapes principales : trempage, ébullition, fermentation et post-fermentation. L'ébullition détruit les germes et les bactéries non résistants à la chaleur, préservant ainsi les bactéries résistantes à la chaleur. Le processus de fermentation dure 3 jours dans des conditions ambiantes. Le Thua Nao fraîchement préparé ou humide peut être cuit à la vapeur ou rôti avant consommation. Dans des conditions ambiantes, le Thua Nao humide peut être stocké pendant environ 2 jours. Par conséquent, des processus de post-fermentation ont été développés pour prolonger sa durée de conservation. Par exemple, le Thua Nao cuit est écrasé en un disque plat circulaire puis séché au soleil, ce qui donne la forme séchée du Thua Nao, qui peut être stocké pendant plusieurs mois1.

Une étude précédente a démontré la valeur du Thua Nao en tant que ressource potentielle pour les composés bioactifs et bénéfiques pour la santé2. Thua Nao contient 57,22–64,78 % d'humidité, 4,70–5,44 % de cendres, 12,92–28,06 % de fibres brutes, 38,94–42,06 % de protéines brutes et 20,37–25,22 % de matières grasses3. Les avantages potentiels des composés bioactifs, tels que les composés phénoliques et les activités antioxydantes, ne proviennent pas seulement des matières premières, mais sont également libérés par les bactéries lors de la fermentation du soja3. En utilisant des méthodes dépendantes de la culture, les espèces de Bacillus seraient des micro-organismes prédominants dans Thua Nao4. Cependant, Thua Nao est fabriqué à partir d'un mélange de microflore naturelle, qui ne peut pas être facilement cultivée. Le processus de fermentation avec une microflore mixte permet aux micro-organismes de s'entraider pour produire des substances importantes liées à la nutrition et à la santé, telles que les peptides, la vitamine B, les acides gras et les acides gras à chaîne courte (AGCC). La digestion du soja par la microflore crée les AGCC, c'est-à-dire l'acétate, le propionate et le butyrate, qui servent de nutriments essentiels aux cellules muqueuses du côlon, stimulant ainsi la prolifération muqueuse et le flux sanguin5 et contrôlant les niveaux de sucre5, le métabolisme6 et le taux de cholestérol7. Par conséquent, Thua Nao est considéré comme une bonne source de substances importantes, de prébiotiques et de bactéries bénéfiques pour la santé.

Thua Nao est produit dans diverses régions du nord de la Thaïlande ; cependant, les données sur les communautés bactériennes de Thua Nao dans différentes régions sont encore limitées. L'étude des communautés bactériennes peut permettre de mieux comprendre les rôles et les propriétés fonctionnelles des bactéries en fermentation à Thua Nao. Les microbes utilisés pour la fermentation naturelle proviennent de la culture du soja. Nous avons donc émis l'hypothèse que différentes régions de culture du soja ou conditions géographiques pourraient influencer la composition du microbiote et finalement la composition des AGCC. Le natto pourrait être un bon témoin par rapport à d'autres aliments fermentés (par exemple, le poisson fermenté et les cornichons) car il s'agit également d'un soja fermenté, mais avec l'ajout de Bacillus comme culture starter. Pour résoudre ce problème, nous identifions d'abord les taxons bactériens de Thua Nao dans six régions différentes du nord de la Thaïlande à l'aide d'approches indépendantes de la culture (c'est-à-dire le séquençage du gène de l'ARNr 16S). Deuxièmement, nous avons analysé les corrélations entre les taxons bactériens et les types et quantités d'AGCC à Thua Nao à l'aide de la chromatographie gaz-liquide. Les résultats ont révélé les bactéries bénéfiques qui peuvent être utilisées comme cultures starter pour améliorer la qualité de la production de Thua Nao.

Soixante-cinq échantillons de Thua Nao, composés de graines de soja fermentées humides et séchées, ont été collectés dans 37 villages de six provinces du nord de la Thaïlande. Le natto commercial a également été utilisé comme échantillon de soja fermenté non traditionnel (témoin ; n = 1), provenant d'un supermarché en Thaïlande. La figure 1 montre une carte de la Thaïlande avec les nombres d'échantillons dans chaque province.

Lieux d'échantillonnage et nombre de Thua Nao séchés et humides dans le nord de la Thaïlande. Le nombre au centre du cercle représente le nombre de villages dans chaque province, tandis que le nombre dans les couleurs orange et verte indique le nombre d'échantillons séchés et humides dans chaque province, respectivement. La carte a été téléchargée à partir de Google Data Studio, et un graphique et un pointeur supplémentaires ont été dessinés à l'aide de Microsoft Excel v16.66.1, Microsoft PowerPoint v16.66.1 et Inkscape v1.1.

Le nombre médian de séquences de lecture appariées brutes de 250 pb générées par le séquençage Illumina avec les gènes d'ARNr 16S était de 66 438 (plage de 36 740 à 82 116). Après prétraitement, le nombre médian de séquences a été réduit à 48 645,5 (gamme de 31 864 à 60 876). Les séquences ont ensuite été regroupées en 652 caractéristiques basées sur la méthode de variante de séquence d'amplicon (ASV), la majeure partie de la longueur de séquence de 253 pb correspondant à la taille approximative de la région V4 des gènes d'ARNr 16S. Le fichier supplémentaire S1 montre les tables d'abondance taxonomique au niveau du phylum et du genre.

Soixante-six échantillons de soja fermenté (30 Thua Nao humides, 35 Thua Nao séchés et 1 natto) ont été obtenus et analysés pour les communautés bactériennes en fonction de la diversité des séquences de gènes d'ARNr 16S. Quatre embranchements ont été identifiés dans les deux types de soja fermenté. Les firmicutes étaient le phylum le plus courant dans les types séchés (95, 98% + 11, 55%), humides (88, 42% + 15, 46%) et les deux (92, 66% + 13, 71%) (Fig. 2A). Les abondances relatives de Proteobacteria, Actinobacteriota et Bacteroidota étaient de 10, 26%, 0, 85% et 0, 47% dans les échantillons humides, respectivement, et de 3, 85%, 0, 08% et 0, 09% dans les échantillons séchés, respectivement (Fig. 2B). Douze genres avaient des abondances relatives ≥ 1% (Fig. 2D). Bacillus était le genre dominant dans les types séchés (86,41% + 16,41%), humides (47,19% + 30,63%) et les deux (66,94% + 32,25%; Fig. 2D). Fait intéressant, Lactobacillus, Enterococcus et Globicatella ont été enrichis dans les échantillons humides.

Les abondances relatives en pourcentage des compositions taxonomiques ont été comparées entre les graines de soja fermentées séchées (n = 35) et humides (n = 30) au niveau de l'embranchement (A) et du genre (B) et entre les six provinces au niveau de l'embranchement (C) et du genre. (D) niveaux.

Les diversités alpha ont été estimées pour tous les profils de microbiome du soja fermenté et comparées entre le soja fermenté sec et humide sur la base de la diversité de Shannon (Fig. 3A), de la diversité de Simpson (Fig. S1B), de l'indice de Pielou (Fig. S1C) et de la diversité phylogénétique de Faith. (Fig. S1D) en utilisant le test de somme des rangs de Wilcoxon. Toutes les mesures de diversité alpha ont montré que les diversités microbiennes des graines de soja fermentées humides étaient significativement plus élevées que celles des graines de soja fermentées séchées. Les diversités bêta ont été mesurées entre les échantillons de soja fermenté (Fig. 3 et S2). Les différences entre les types de soja fermenté ont été évaluées à l'aide des tests PERMANOVA (Fig. 3B), qui ont indiqué que le soja et le natto fermentés humides et séchés avaient des modèles de microbiote différents (P = 1e-04). Des taxons abondants différentiels entre les graines de soja fermentées séchées et humides ont été identifiés avec le critère de coupure P <0, 05 (Fig. 3C et D).

Comparaison des diversités bactériennes dans le soja et le natto fermentés séchés (rouge ; n = 35) et humides (bleu ; n = 30) et le natto (vert ; n = 1). Tests de signification statistique pour la diversité alpha entre les graines de soja fermentées séchées et humides sur la base de la diversité de Shannon (A). Diversité bêta parmi les graines de soja et le natto séchés et fermentés par voie humide basée sur la dissemblance Bray-Curtis et PERMANOVA (B). Analyse de l'abondance différentielle entre le soja séché et humide fermenté au niveau du phylum (C) et du genre (D) à l'aide des méthodes ANCOM-BC ; la valeur Q représente une valeur P qui a été ajustée pour le taux de fausses découvertes (FDR).

Les compositions bactériennes parmi les graines de soja fermentées ont montré que Lampang avait le plus grand nombre de genres bactériens (14 genres) avec une abondance relative ≥ 1%, suivi de Chiang Mai, Chiang Rai, Phayao, Mae Hong Son et Lamphun (Fig. 2D). Fait intéressant, les protéobactéries avaient des abondances plus faibles à Chiang Rai et Phayao que dans les autres provinces (Fig. 2C).

Les diversités alpha en termes de diversité de Shannon, de diversité de Simpson, d'indice de Pielou et de diversité phylogénétique de Faith ont été comparées entre les six provinces à l'aide des tests de Kruskal-Wallis (Fig. S3). Les résultats statistiques ont indiqué que les diversités microbiennes parmi les six provinces différaient significativement dans l'état humide en fonction de la diversité phylogénétique de Faith (P = 0, 0011; Fig. 4A). Cependant, les diversités alpha n'étaient pas significativement différentes entre les six provinces à l'état séché (P = 0, 06; Fig. 4B). Les diversités alpha à Chiang Rai, Chiang Mai et Lampang étaient plus élevées que celles de Lamphun, Mae Hong Son et Phayao. Les différences entre deux échantillons ont été mesurées en fonction de la dissimilarité Bray-Curtis, de la distance Jaccard, de la distance UniFrac pondérée et de la distance UniFrac non pondérée (Fig. S4). Les diversités bêta basées sur quatre mesures ont été analysées et visualisées à l'aide de graphiques d'analyse des coordonnées principales (PCoA) (Fig. S4). PERMANOVA a indiqué des différences significatives dans les profils bactériens des six provinces (P = 0, 001; Figs. 4C et S3).

Comparaison des diversités phylogénétiques bactériennes et de la dissimilarité dans le soja fermenté entre les provinces. Tests de signification statistique pour la diversité alpha entre les provinces basés sur la diversité phylogénétique de Faith dans des conditions humides (n = 30) (A) et sèches (n = 35) (B) à l'aide des tests de Kruskal – Wallis. La diversité bêta parmi le soja séché et fermenté humide de six provinces et le natto japonais (n = 1) basé sur la dissemblance Bray-Curtis a été analysé via PERMANOVA (C).

Les graines de soja fermentées ont été mesurées pour leurs niveaux de SCFA. L'acétate (P = 2,8e−08), le propionate (P = 0,0044), le butyrate (P = 0,0021) et l'isovalérate (P = 0,017) étaient plus élevés dans le soja fermenté humide (n = 30) que dans le soja fermenté séché (n = 35) basé sur les tests de somme des rangs de Wilcoxon (Fig. 5A). Les formes séchées et humides des graines de soja fermentées ne différaient pas significativement pour l'isobutyrate, le valérate, l'hexanoate ou les AGCC totaux (Fig. 5A). Les concentrations de fermentation dans les formes séchées et humides des graines de soja fermentées étaient plus élevées pour l'acide acétique que pour les autres AGCC (Fig. 5A). L'acétate et l'isovalérate étaient les plus abondants à Chiang Rai et Lampang ; L'isobutyrate et les AGCC totaux étaient dominants à Chiang Rai (Fig. 5B). Lampang et Chiang Mai contenaient respectivement les quantités les plus élevées de propionate et de butyrate (Fig. 5B). Chiang Mai avait la plus grande quantité d'hexanoate (Fig. 5B). Les six provinces avaient les plus fortes concentrations de fermentation d'acétate à Thua Nao (Fig. 5B).

Comparaison des concentrations d'AGCC dans le soja fermenté. Les graines de soja fermentées séchées (n = 35) et humides (n = 30) ont été comparées à l'aide du test de somme des rangs de Wilcoxon (A) et évaluées parmi six provinces à l'aide du test de Kruskal-Wallis avec un seuil de P < 0,05 (B).

Les corrélations (R) entre les abondances bactériennes et les concentrations de SCFA basées sur le coefficient de corrélation de Spearman étaient faibles et non significatives (P > 0,05) (Fig. 6 et Tableau S4). Les valeurs R les plus élevées ont été trouvées entre l'augmentation de l'abondance de Weissella (R = 0,45), de Lactobacillus (R = 0,47) ou de Clostridium_sensu_stricto-18 (R = 0,46) et les concentrations d'acétate (tableau S4). En utilisant un seuil de 1% pour l'abondance relative, Weissella a été trouvé à Chiang Rai, Lampang et Phayao; Lactobacillus a été trouvé à Chiang Rai et Lampang, et Clostridium_sensu_stricto-18 n'a été trouvé qu'à Lampang (tableau S4). Pour augmenter les niveaux de propionate, Globicatella (R = 0,40), Ignatzschineria (R = 0,5), Clostridium_sensu_stricto-15 (R = 0,44), Clostridium_sensu_stricto-18 (R = 0,66), Paenalcaligenes (R = 0,40) ou Staphylococcus (R = 0,46 ) les abondances étaient les plus grands membres bactériens dans le soja fermenté (tableau S4). Globicatella et Clostridium_sensu_stricto-15 ont été trouvés à Lampang ; Ignatzschineria a été trouvé à Lampang, Chiang Mai et Chiang Rai ; Paenalcaligenes a été trouvé à Lampang et Chiang Mai, et Staphylococcus a été trouvé à Chiang Mai et Phayao, avec une abondance relative ≥ 1 % (tableau S3). Par rapport à d'autres abondances bactériennes, Globicatella (R = 0,44), Ignatzschineria (R = 0,56), Corynebacterium (R = 0,49), Sphingobacterium (R = 0,49), Clostridium_sensu_stricto-15 (R = 0,50), Clostridium_sensu_stricto-18 (R = 0,59 ), Vagococcus (R = 0,41), Paenalcaligenes (R = 0,40), Staphylococcus (R = 0,44) et Comamonas (R = 0,40) ont eu le plus d'impact sur l'augmentation des concentrations de butyrate (tableau S4). De plus, l'augmentation des SCFA totaux était basée sur l'augmentation de l'abondance de Weissella (R = 0,44) et de Lactobacillus (R = 0,46) (tableau S4). Corynebacterium a été trouvé à Chiang Mai; Sphingobacterium a été trouvé à Lampang; Vagococcus a été trouvé à Lampang et Chiang Mai, et Comamonas a été trouvé à Mae Hong Son, tous avec une abondance relative ≥ 1% (tableau S3).

Corrélations par paires entre les SCFA et les genres bactériens dominants avec les abondances totales les plus élevées dans les échantillons de> 0, 1% en utilisant le coefficient de corrélation de Spearman.

Dans cette étude, nous avons caractérisé le microbiote de Thua Nao de différentes régions du nord de la Thaïlande et identifié les bactéries bénéfiques synthétisant potentiellement des AGCC. Nous avons émis l'hypothèse que les matières premières utilisées dans la production de Thua Nao (c'est-à-dire le soja et la flore naturelle de chaque région) donneraient divers résultats de classification bactérienne. Nous avons également évalué deux types de Thua Nao, humides et séchés, en utilisant le séquençage du gène ARNr 16S, une méthode indépendante de la culture. Au niveau du phylum, Firmicutes était le plus abondant et le plus courant dans les produits de soja fermentés humides et séchés (Fig. 2A). Les membres de Firmicutes comprennent principalement des bactéries bénéfiques qui jouent un rôle important dans la relation entre les bactéries intestinales et la santé humaine. Certains membres de Firmicutes peuvent fermenter les fibres alimentaires des légumineuses en produits finaux métabolites, y compris les AGCC8. Nous avons ensuite analysé les genres prédominants de Firmicutes avec des abondances ≥ 1 %. Les résultats actuels suggèrent que Bacillus était le plus abondant dans les échantillons humides et séchés, ce qui était cohérent avec les compositions microbiennes rapportées précédemment2,4,9. Comme prévu, Bacillus était également le genre bactérien prédominant dans l'échantillon de natto, qui était le contrôle dans ce travail. Cependant, nous n'avions qu'un seul échantillon pour le natto, ce qui ne nous permettait pas d'effectuer de test statistique entre le natto et le Thua Nao.

Compte tenu des différences de diversité bactérienne entre Thua Nao humide et séché, les analyses d'abondance différentielle ont montré une forte abondance de bactéries productrices d'acide lactique (LAB). Les inoculants LAB sont utilisés pour produire divers produits animaux et végétaux et pour développer les saveurs, les arômes et les textures des aliments fermentés10. Les différentes proportions de LAB dans les échantillons humides et séchés pourraient être des facteurs de la viabilité des LAB dans les Thua Nao conservés. Deux genres de LAB, Lactobacillus et Enterococcus, très abondants dans les échantillons humides, ont été signalés comme capables d'hydrolyser les protéines de soja11,12. Lactobacillus spp. sont couramment utilisés comme probiotiques pour les suppléments humains et animaux, et des cultures mixtes de Lactobacillus sont utilisées pour fermenter le tourteau de soja13. Bien que certains entérocoques soient considérés comme des déterminants pathogènes, ces bactéries présentent également plusieurs caractéristiques positives. De nombreuses souches d'entérocoques efficaces ont été décrites comme ferments potentiels dans divers produits fermentés. L'utilisation d'entérocoques comme cultures starter ou co-cultures a considérablement augmenté. Cependant, les facteurs naturels mixtes des substrats de soja et d'autres bactéries prédominantes (telles que Bacillus, LAB et d'autres membres bactériens) ainsi que d'autres microbes (tels que les levures et les moisissures) pourraient créer des saveurs, des arômes, des textures et des valeurs nutritives uniques dans Thua Nao humide.

Thua Nao est un aliment fermenté populaire dans le nord de la Thaïlande car il peut être utilisé comme ingrédient pour augmenter la saveur des aliments cuits et peut être consommé directement avec du riz gluant ou du riz1. Divers facteurs dans la fabrication de Thua Nao, y compris les types et la quantité de fibres dans le soja cru, le microbiote naturel, l'environnement et la durée de fermentation varient selon les provinces, ce qui entraîne des profils de microbiome distincts et des goûts différents de Thua Nao. Nos résultats indiquent que les échantillons de Thua Nao de Lampang, Chiang Mai et Chiang Rai avaient une diversité microbienne plus élevée que ceux de Lamphun, Mae Hong Son et Phayao à l'état humide (Fig. 4A).

Thua Nao contient de fortes concentrations de glucides non digestibles, qui ne peuvent pas être digérés par les enzymes endogènes dans l'estomac et l'intestin grêle, mais constituent un substrat de fermentation potentiel pour les microbes bénéfiques dans l'intestin et sont considérés comme des prébiotiques14,15,16. La fermentation utilisant des microbes bénéfiques naturels dans la production d'aliments fermentés implique l'hydrolyse des glucides non digestibles en sucres, qui sont ensuite fermentés pour produire principalement des AGCC ainsi que du H2 et du CO216,17. Plusieurs études ont rapporté que les types et les quantités d'AGCC dépendent fortement de la digestibilité bactérienne ainsi que de la fermentescibilité et de la viscosité des fibres16,17. Les trois principaux AGCC, l'acide acétique (C2), l'acide propionique (C3) et l'acide butyrique (C4), aident à libérer de l'énergie pour la croissance microbienne intestinale et les effets physiologiques chez l'homme16. Les AGCC sont volatils et peuvent être produits par fermentation anaérobie de fibres alimentaires6,18. Ces métabolites étaient significativement plus élevés dans le Thua Nao humide que dans le Thua Nao séché (Fig. 5A), probablement en raison de leur volatilité et de la destruction des activités enzymatiques anaérobies au cours du processus de séchage15,18,19.

L'acide acétique était le SCFA le plus abondant dans les échantillons de Thua Nao humides et séchés. Des études antérieures ont révélé que les principaux producteurs d'acide acétique dans la fermentation solide comprenaient Clostridium anaérobie, Ignatzschineria, LAB et les bactéries aérobies de l'acide acétique (AAB)20,21,22. Dans cette étude, Clostridium sensu stricto, Ignatzschineria, LAB (c.-à-d. Lactobacillus, Pediococcus, Streptococcus, Enterococcus, Globicatella, Vagococcus et Weissella) et AAB (c.-à-d. Acetobacter) dans Thua Nao pourraient être associés à la production d'acide acétique pendant la fermentation. Les deux concentrations les plus élevées d'acide acétique trouvées à Chiang Rai et Lampang correspondaient à la prédominance de LAB, AAB, Ignatzschineria et Clostridium spp.

Les trois principales voies de formation du propionate sont les voies du succinate, de l'acrylate et du propanediol23. Propionibacterium et Clostridium, qui sont des anaérobies, ont été explorés en tant que producteurs potentiels de propionate via la voie du succinate20,24. L'analyse de corrélation a montré que les concentrations de propionate étaient étroitement liées aux abondances de Globicatella, Ignatzschineria, Clostridium sensu stricto, Paenalcaligenes et Staphylococcus. Clostridium, Ignatzschineria et Paenalcaligenes seraient des producteurs potentiels d'acide propionique25,26. Bien qu'Ignatzschineria et Paenalcaligenes appartiennent au phylum Proteobacteria, impliqué dans les infections humaines27, ces genres ont été trouvés en très faible quantité (< 1 %) dans le Thua Nao séché (Tableau S2). La plus grande quantité d'acide propionique a été observée à Lampang, suivie de Chiang Mai, et correspondait aux abondances relatives les plus élevées de Globicatella, Clostridium sensu stricto et Staphylococcus.

L'analyse de corrélation a montré que les concentrations de butyrate étaient étroitement liées à l'abondance de Globicatella, Ignatzschineria, Corynebacterium, Sphingobacterium, Clostridium sensu stricto, Vagococcus, Paenalcaligenes, Staphylococcus et Comamonas. Des études antérieures ont montré que le butyrate peut être généré à partir de la fermentation de LAB tels que Globicatella, Vagococcus, Staphylococcus ; Bacillus spp.; Corynebacterium, Comamonas, Sphingobacterium, Ignatzschineria; et Clostridium sensu stricto28,29,30. La plus grande quantité d'acide butyrique a été observée à Chiang Mai, suivie de Lampang, et correspondait aux abondances relatives les plus élevées de Corynebacterium à Chiang Mai, Sphingobacterium et Vagococcus à Chiang Mai et Lampang, Globicatella et Clostridium sensu stricto à Lampang, et Comamonas à Mae Hong Son. L'analyse de corrélation a montré que les concentrations totales d'AGCC étaient étroitement liées aux abondances relatives de Weissella et de Lactobacillus. Les quantités les plus élevées d'AGCC totaux observées à Chiang Rai correspondaient aux abondances relatives les plus élevées de Weissella et de Lactobacillus.

Nos résultats indiquent que les Thua Nao humides et séchés des provinces du nord de la Thaïlande sont des sources potentielles d'AGCC. Notamment, nous avons utilisé une approche de microbiome basée sur les amplicons pour observer les communautés bactériennes de Thua Nao, et les résultats étaient basés sur des bactéries au niveau du genre. Cette étude donne un aperçu des associations SCFA-microbiote à Thua Nao, qui pourraient être utilisées pour développer une culture starter pour la production de soja fermenté enrichi en SCFA comme aliment complémentaire pour moduler la santé tout au long de la vie. L'effet du microbiome de Thua Nao sur les produits finaux de fermentation SCFA devrait être étudié plus avant à l'aide d'autres approches, notamment la métagénomique du fusil de chasse, le séquençage du génome et la métabolomique.

Soixante-cinq produits Thua Nao (échantillons de soja naturellement fermentés) composés de 30 échantillons humides et 35 échantillons séchés ont été collectés dans 36 villages de six provinces du nord de la Thaïlande : Chiang Rai (14 séchés, 5 humides), Chiang Mai (5 séchés, 5 humides). ), Mae Hong Son (5 séchés, 5 humides), Lampang (5 séchés, 8 humides), Lamphun (5 séchés, 5 humides) et Phayao (1 séché, 2 humides). Nous avons également utilisé du natto, une graine de soja du Japon fermentée à l'aide d'un agent levant comme témoin. Dans 27 des 36 villages, nous avons collecté des échantillons de soja fermenté humide et séché. La teneur en humidité a été analysée pour la détermination du poids.

L'ADN génomique total a été extrait de 67 échantillons à l'aide du kit microbien DNeasy® Power Food® (Qiagen, MD, USA). La concentration d'ADN a été déterminée à l'aide d'un instrument Nanodrop (Thermo Scientific, USA). L'intégrité de l'ADN a été contrôlée sur un gel d'agarose à 1 %. Les échantillons d'ADN extraits ont été expédiés au Centre d'innovation de Génome Québec (Université McGill, Montréal, QC, Canada) pour l'amplification par PCR, la préparation de la bibliothèque et le séquençage. Une PCR a été réalisée pour produire des régions V4 du gène d'ADNr 16S en utilisant les amorces conservées 515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′) et 806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′). Un système de PCR haute fidélité FastStart® (Roche, Mannheim, Allemagne) a été utilisé pour 26 cycles d'amplification. Un échantillon blanc sans matrice d'ADN a été utilisé comme contrôle négatif. La bibliothèque a été séquencée sur une plate-forme Illumina MiSeq selon le protocole de la société, et des lectures appariées de 250 pb ont été générées. Une communauté fictive (Zymo Research, USA), comprenant 10 espèces bactériennes, a été utilisée comme contrôle positif.

L'analyse SCFA a été effectuée en utilisant la chromatographie en phase gazeuse selon les méthodes de 31, 32 avec de légères modifications. Un gramme d'échantillons de Thua Nao broyés a été mélangé avec 3 mL de solution d'étalon interne (acide heptanoïque, 5,04 µM/g d'échantillon). Les échantillons ont été vortexés et centrifugés à 2 500 × g à 4 ° C pendant 10 min, puis 10 µL d'acide phosphorique 1 M ont été ajoutés à 300 µL du surnageant. Le surnageant a été filtré à travers un filtre en nylon avec une taille de pores de 0,45 µm et 0,2 μL du filtrat ont été injectés dans un chromatographe en phase gazeuse équipé d'un détecteur à ionisation de flamme (GC-FID, modèle 7890A ; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA ) et colonne capillaire (DB-FFAP, 30 m × 0,53 mm × 0,5 µm). La température initiale du four a été maintenue à 90 °C pendant 1 min, puis augmentée à 20 °C/min jusqu'à 190 °C et maintenue pendant 2,5 min. Les températures de l'injecteur et du détecteur ont été fixées à 210 °C. L'hélium a été utilisé comme gaz porteur avec des débits de gaz et des débits de purge du septum de 7,7 et 3,0 ml/min, respectivement. Un mélange SCFA standard contenant de l'acétate, du propionate, du butyrate, de l'isobutyrate, du valérate, de l'isovalérate et de l'hexanoate ainsi que du phénol et du p-crésol a été utilisé pour le calcul. Les concentrations de SCFA ont été calculées en µM/g. La quantification a été effectuée sur la base de la surface de pic relative de chaque étalon SCFA, en ajustant la quantité en fonction de l'étalon interne.

Les séquences étaient des lectures appariées de 250 pb au format FASTQ. Les séquences ont été importées dans QIIME2-2022.233. Les adaptateurs et les amorces ont été coupés à partir de l'avant des lectures avant et arrière à l'aide de q2-cutadapt. Les séquences ont été tronquées aux positions avant et arrière ; les lectures appariées ont ensuite été fusionnées avec des régions se chevauchant dans des séquences représentatives de l'ARNr V4 16S, et les séquences chimériques ont été rejetées à l'aide de q2-dada2. Les séquences prétraitées ont été regroupées en caractéristiques sur la base de la méthode des variants de séquence d'amplicon, et le nombre de caractéristiques dans les échantillons a été organisé dans un tableau d'abondance34. Les caractéristiques ont été annotées taxonomiquement sur la base de SILVA v13835. Une normalisation de raréfaction a été appliquée pour rendre tous les échantillons comparables au nombre égal de lectures. Les abondances taxonomiques de tous les échantillons ont été calculées à l'aide de q2-classify-sklearn.

Les abondances taxonomiques au niveau du genre ont été utilisées pour calculer les paramètres de diversité. La diversité alpha basée sur la diversité de Shannon, la diversité de Simpson, la régularité de Pielou et la distance phylogénétique de Faith a été estimée pour tous les échantillons. La diversité alpha a été comparée entre les types de soja à l'aide des tests de somme des rangs de Wilcoxon et évaluée entre les provinces à l'aide des tests de Kruskal–Wallis. Des comparaisons par paires entre les provinces ont été effectuées à l'aide des tests de somme des rangs de Wilcoxon avec plusieurs corrections d'hypothèses. La diversité bêta en termes de dissemblance Bray-Curtis, d'indice de Jaccard, de distance phylogénétique UniFrac et de distance phylogénétique UniFrac pondérée a été calculée pour tous les échantillons. La PCoA a été réalisée à l'aide de Phyloseq v1.36.036.

ANCOM-BC v1.2.237,38,39 a été réalisée pour identifier les microbes différentiellement abondants entre le soja fermenté humide et séché avec le critère P < 0,05.

Les taxons avec des abondances relatives totales < 0,1 % ont été filtrés du tableau taxonomique. Les corrélations par paires entre les profils taxonomiques et les concentrations de SCFA ont été calculées à l'aide du coefficient de corrélation de Spearman et visualisées à l'aide de ggplot2 v3.3.5.

Les tests de somme des rangs de Wilcoxon et les tests de Kruskal-Wallis ont été effectués dans R, v4.1.0. Les boîtes à moustaches et les parcelles PCoA ont été créées à l'aide de ggplot2 v3.3.5.

Les données de séquençage ont été soumises au NCBI SRA avec les numéros d'accès SRR20217885– SRR20217951 sous le numéro d'accès BioProject PRJNA852866.

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Nous remercions Traci Raley, MS, ELS, d'Edanz (www.edanz.com/ac) pour l'édition d'un brouillon de ce manuscrit.

PJI a été soutenu par le BRAND's Health Research Award 2019 et la MU-KMUTT Biomedical Engineering and Biomaterials Consortium Grant 2021.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Thidathip Wongsurawat et Sawannee Sutheeworapong.

Division de bioinformatique médicale, Département de recherche, Faculté de médecine Hôpital Siriraj, Université Mahidol, Bangkok, 10700, Thaïlande

Thidathip Wongsurawat & Piroon Jenjaroenpun

Siriraj Long-Read Lab (Si-LoL), Faculté de médecine Hôpital Siriraj, Bangkok, 10700, Thaïlande

Thidathip Wongsurawat & Piroon Jenjaroenpun

Laboratoire de biologie des systèmes et de bioinformatique, Institut de formation et de développement d'installations pilotes, Université de technologie du roi Mongkut, Thonburi, Bangkok, 10150, Thaïlande

Sawannee Sutheeworapong

Département des sciences et technologies alimentaires, Faculté d'agro-industrie, Université Kasetsart, Bangkok, 10900, Thaïlande

Suvimol Charoensiddhi

Programme de bioinformatique et de biologie des systèmes, École des ressources biologiques et de la technologie et École des technologies de l'information, Université de technologie du roi Mongkut, Thonburi, Bangkok, 10150, Thaïlande

Ahmad Nur ad-Din Khoiri

Département de médecine tropicale moléculaire et de génétique, Faculté de médecine tropicale, Université Mahidol, Bangkok, 10400, Thaïlande

Supachai Topanurak

Département de protozoologie, Faculté de médecine tropicale, Université Mahidol, Bangkok, 10400, Thaïlande

Chantira Sutthikornchai

Département de nutrition tropicale et des sciences alimentaires, Faculté de médecine tropicale, Université Mahidol, Bangkok, 10400, Thaïlande

Pornrutsami Jintaridth

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Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Correspondance à Thidathip Wongsurawat ou Pornrutsami Jintaridth.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Wongsurawat, T., Sutheeworapong, S., Jenjaroenpun, P. et al. L'analyse du microbiome des graines de soja fermentées traditionnelles thaïlandaises révèle des taxons bactériens associés aux acides gras à chaîne courte. Sci Rep 13, 7573 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34818-0

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Reçu : 27 août 2022

Accepté : 08 mai 2023

Publié: 10 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-34818-0

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